Chromatographie

Chromatographie : définition

Disons que nous avons une encre d'un violet profond. Bien qu'il semble qu'elle ne contienne qu'une seule couleur, la chromatographie nous permet de la diviser en tous ses pigments séparés - bleus, rouges, peut-être un peu de jaune et de vert. Ceci n'est qu'un exemple de chromatographie. Dans ce cas, elle est utilisée pour séparer un mélange. Mais la chromatographie peut également être utilisée pour analyser des mélanges, par exemple pour identifier les principes actifs d'un médicament ou pour découvrir les produits d'une réaction.

La méthode de chromatographie

Il existe plusieurs types de chromatographie et chacun d'entre eux a un processus légèrement différent. Cependant, la méthode générale reste la même. La chromatographie comprend les étapes suivantes :

• Prends un mélange soluble, connu sous le nom de soluté.
• Ajoute une petite quantité du mélange à un solide, un liquide ou un gaz statique. Ce milieu statique est appelé la phase stationnaire.
• Ajoute une sorte de solvant. On l'appelle la phase mobile.
• Le solvant dissout le mélange et le transporte à travers la phase stationnaire.
• Les différents composants du mélange traversent la phase stationnaire à des vitesses différentes. Pour cette raison, ils se séparent en taches ou bandes claires et distinctes, que nous pouvons visualiser sur un chromatogramme.

L'une des formes les plus simples de chromatographie est la chromatographie sur papier. Il est fort probable que tu l'aies déjà pratiquée à l'école. Voici à quoi ressemble la configuration typique de la chromatographie sur papier :

Fig. 1- La configuration typique pour la chromatographie sur papier.

Principes de la chromatographie

Nous t'avons présenté quelques mots-clés plus haut, notamment phase stationnaire, phase mobile et chromatogramme. Il s'agit de certains des principes de base de la chromatographie. Voyons maintenant ce qu'ils signifient exactement.

Phase stationnaire

La phase stationnaire est, comme son nom l'indique, stationnaire. Elle ne bouge pas. Le papier et la poudre de silice en sont des exemples.

La phase mobile

Contrairement à la phase stationnaire, la phase mobile se déplace. C'est un solvant qui dissout le soluté que tu veux analyser ou séparer, et le transporte à travers la phase stationnaire.

Chromatogrammes

Une fois la chromatographie terminée, tu auras des preuves du processus. Le mélange s'est séparé sur la phase stationnaire en différentes taches ou bandes. La phase stationnaire restante, avec toutes ses taches, s'appelle le chromatogramme.

Chromatographie : schéma

Par exemple, en chromatographie sur papier, la phase stationnaire est une feuille de papier. Une fois l'expérience terminée, le chromatogramme est le papier avec la disposition finale des différentes taches.

Fig. 2-Un chromatogramme pour la chromatographie sur papier.

Concentrons-nous sur deux nouveaux termes : l'affinité relative et le facteur de rétention.

Affinité relative

Les composants du mélange de solutés se déplacent à des vitesses différentes à travers la phase stationnaire. Cela est dû à leur affinité relative avec les deux phases.

On dit que les composants qui subissent une plus forte attraction vers la phase stationnaire ont une plus forte affinité avec la phase stationnaire. Ils sont moins solubles dans le solvant et sont plus attirés par le milieu statique. La phase mobile ne peut pas les transporter aussi facilement, ce qui signifie que les composants se déplacent plus lentement à travers la phase stationnaire.

En revanche, on dit que les composants qui subissent une plus forte attraction de la phase mobile ont une plus forte affinité avec cette dernière. Ils sont plus solubles dans le solvant et moins attirés par le milieu statique. La phase mobile est très efficace pour les transporter, de sorte que ces composants traversent plus rapidement la phase stationnaire.

Quelle est la cause de ces différences d'affinités relatives ? Comme nous l'avons mentionné, tout est lié à l'attraction des deux phases.

Disons que la phase stationnaire est constituée d'une molécule polaire. Cela signifie qu'elle subit des forces dipôle-dipôle permanentes entre elle et tout autre composant polaire du mélange de départ. D'un autre côté, on utilise généralement un solvant non polaire. Cela signifie qu'il n'y aurait que de faibles forces de van der Waal entre le solvant et les composants. Les composants polaires subissent donc une attraction beaucoup plus forte entre eux et la phase stationnaire, qu'entre eux et la phase mobile. Ils sont plus attirés par la phase stationnaire, sont moins solubles dans le solvant, on peut donc dire qu'ils ont une plus grande affinité avec la phase stationnaire.

Facteurs de rétention

Nous savons maintenant que les différents composants se déplacent à des vitesses différentes à travers la phase stationnaire en raison de leurs affinités relatives avec les deux étapes. Cela signifie que dans un intervalle de temps donné, les différents composants parcourent des distances différentes. Nous pouvons le constater car ils apparaissent sous forme de taches claires et distinctes.

Nous utilisons le rapport entre la distance parcourue par chaque tache et la distance totale parcourue par le solvant pour calculer des facteurs de rétention, ou valeurs Rf.

Les valeurs Rf sont importantes car elles nous aident à identifier les composants. Un composant particulier produit toujours la même valeur Rf dans certaines conditions, c'est-à-dire si des éléments comme la température, la phase mobile et la phase stationnaire sont exactement les mêmes. Si nous calculons la valeur Rf d'un composant particulier, nous pouvons la comparer aux valeurs contenues dans une base de données pour découvrir l'identité de cette substance inconnue.

Pour trouver les valeurs Rf, il faut diviser la distance parcourue par chaque composant par la distance totale parcourue par le solvant.

\( Valeur Rf= \frac {distance\ parcourue\ par\ le\ soluté}{distance\ parcourue\ par\ le\ solvant} \)

Fig. 3- Calculer les valeurs de Rf.

Dans l'exemple ci-dessus, la tache bleue a parcouru \( 7,4 cm \) et le solvant a parcouru \( 9,8 cm \) . Pour calculer sa valeur Rf, on utilise l'équation suivante :

\( 7{.}4 \div 9{.}8=0{.}755=0{.}76 \)

Les valeurs Rf n'ont pas d'unités et sont généralement indiquées avec deux décimales.

Maintenant que tu connais les affinités relatives, peux-tu prédire comment les valeurs Rf varient entre les composants ?

• Les composants ayant une plus grande affinité avec la phase stationnaire se déplacent plus lentement dans le milieu. Ils se déplacent moins loin dans une période de temps donnée et ont donc un facteur de rétention plus faible.
• Les composants ayant une plus grande affinité avec la phase mobile se déplacent plus rapidement dans le milieu. Ils se déplacent plus loin dans une période de temps donnée et ont donc un facteur de rétention plus élevé.

Types de chromatographie

Il existe plusieurs types de chromatographie. Ils diffèrent par leurs phases mobiles et stationnaires et leurs méthodes, mais tous suivent les principes décrits ci-dessus. Les types comprennent :

• La chromatographie sur couche mince (CCM).
• La chromatographie sur papier.
• Chromatographie en phase gazeuse.
• La chromatographie sur colonne.
• Chromatographie de partage.
• Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC).

Chromatographie sur couche mince

Principe de la chromatographie sur couche mince

Nous utilisons un solvant, appelé phase mobile, pour dissoudre un échantillon d'un mélange soluble. Le solvant entraîne le mélange vers le haut d'un support statique appelé phase stationnaire.

Certains composants du mélange sont entraînés plus rapidement que d'autres vers le haut du support solide par le solvant. On dit que les composants qui voyagent plus vite présentent une plus grande affinité avec la phase mobile. Celle-ci sépare le mélange en ses composants et produit un chromatogramme.

Nous utilisons ensuite les distances parcourues par les composants pour calculer les valeurs Rf. Celles-ci nous aident à identifier le composant.

Comment ces principes de base s'appliquent-ils à la chromatographie sur couche mince ?

Quelle est la phase stationnaire de la chromatographie sur couche mince ?

Dans la chromatographie sur couche mince, la phase stationnaire est - comme son nom l'indique - une couche de gel de silice ou d'alumine sur une fine plaque de plastique ou de métal. Nous verrons dans un instant pourquoi le gel de silice est utilisé.

Quelle est la phase mobile de la chromatographie sur couche mince ?

Il existe de nombreuses possibilités en matière de phase mobile : tu peux utiliser des alcools, des alcènes ou même simplement de l'eau distillée ! Tout dépend du comment le solvant dissout ton mélange. Mais en CCM, nous ajoutons souvent une substance supplémentaire qui devient fluorescente à la lumière UV. Cela s'avère utile pour visualiser le résultat final de la pratique, qui est le chromatogramme.

Chromatographie sur couche mince : Protocole

Maintenant que nous savons comment fonctionne la CCM, nous pouvons essayer de voir comment procéder. Nous commencerons par décrire les étapes avant de les expliquer plus en détail.

1. Prends une plaque en plastique ou en métal et étale-y une fine couche de gel de silice ou d'alumine, c'est-à-dire ta phase stationnaire.
2. Trace une fine ligne au crayon sur le fond de la phase stationnaire et place un point de ton mélange soluble au centre de la ligne.
3. Place la plaque verticalement dans un bécher contenant un petit volume de ton solvant, la phase mobile. Veuille à ne toucher la plaque que sur les bords et à ce que le niveau de solvant soit inférieur à la ligne de crayon avec la tache de mélange.
4. Tapisse les parois du bécher avec du papier filtre imbibé de solvant et couvre le bécher avec un couvercle. Laisse maintenant l'installation jusqu'à ce que le solvant ait parcouru presque tout le chemin vers le haut de la plaque.
5. Une fois que le solvant a presque atteint le haut de la plaque, retire la plaque du bécher et marque la position du front du solvant avec un autre trait de crayon. Ton chromatogramme est maintenant prêt à être visualisé et analysé.

Chromatographie sur colonne

La chromatographie sur colonne est la technique utilisée pour séparer les composants d'un mélange à l'aide d'une colonne d'adsorbant approprié emballée dans un tube de verre. Le mélange est placé au sommet de la colonne, et un éluant approprié s'écoule lentement le long de la colonne.

La séparation des composants dépend du degré d'adsorption des composants sur la colonne d'adsorbant mural. Le composant ayant la plus grande capacité d'absorption est retenu en haut de la colonne, tandis que les autres s'écoulent vers le bas à des hauteurs différentes¹ .

Chromatographie d'affinité

La chromatographie d'affinité permet une séparation plus spécifique des biomolécules en utilisant une colonne composée d'une phase stationnaire, qui contient des ligands spécifiques à la cible.

Chromatographie d'exclusion

Dans la chromatographie d'exclusion par la taille, une colonne remplie de particules poreuses sépare les composants d'un mélange en fonction de leur taille² .

Voici un tableau pratique pour t'aider à les comparer.

Chromatographie ionique

Chromatographie ionique: Principe et théorie

La solution à étudier est introduite dans un couple calibré et entraînée par les lecteurs dans la colonne.

Les signaux sont détectés par le détecteur de conductivité et traduits par le logiciel en un chromatogramme. Dans le chromatogramme, on observe des pics caractérisés par la conductivité en fonction du cours.

La chromatographie ionique se déroule en trois étapes.

• L'étape de fixation : c'est l'étape où la molécule d'intérêt est retenue par la phase fixe.
• L’étape de lavage : où les molécules contaminantes sont éliminées. Cette étape est également appelée purification.
• L’étape d'élution : où la molécule d'intérêt est récupérée.

Quelle est la phase stationnaire de la chromatographie ionique ?

La phase stationnaire de la chromatographie est souvent appelée résine.

Chacun de ces petits grains qui remplissent la colonne est défini par sa porosité, c'est-à-dire la taille de ses pores, et sa taille de particule, c'est-à-dire son diamètre.

Les résines sont constituées de polymères qui sont de très grosses molécules formant un filet à l'intérieur duquel vont circuler les molécules qui doivent être retenues par la phase stationnaire ou celles qui ne le seront pas.

Dans la phase stationnaire, on distingue les résines anioniques qui peuvent capturer les anions.

Utilisations de la chromatographie

Nous avons déjà abordé certaines des utilisations de la chromatographie, par exemple l'analyse des eaux usées. Mais la chromatographie a une myriade d'applications différentes. Parmi celles-ci, citons :

• La détection des drogues dans l'urine.
• L'analyse des métabolites dans les fluides corporels.
• L'extraction de pigments d'extraits de plantes.
• L'isolement des principes actifs des médicaments.
• La purification de composés.
• Séparation de mélanges de protéines, d'acides aminés ou de nucléotides.
• Le contrôle de la qualité des boissons alcoolisées.