Coloration de Gram

Résultats de la coloration de Gram

Il y a quatre résultats possibles de la coloration de Gram, qui nous aident à classer les bactéries par catégories. Deux sont courants, deux sont peu courants. Nous allons décrire brièvement l'aspect de chaque résultat de coloration.

Résultats courants de la coloration de Gram

• Grampositif

  • À la fin de la procédure de coloration de Gram, les bactéries gram-positives sont violettes.

• Gram négatif

  • À la fin de la procédure de coloration de Gram, les bactéries gram-négatives sont roses.

Résultats peu courants de la coloration de Gram

• Gram variable

  • Les bactéries à Gram variable ont un aspect mixte violet et rose.

• Gram indéterminé

  • Ce sont les bactéries qui ne prennent bien aucune coloration. Elles ne sont ni roses ni violettes. Elles sont incolores à la fin du processus de coloration de Gram.

Méthode de coloration de Gram

Étapes de la coloration de Gram :

1. Une culture contenant des substances inconnues est apportée pour être examinée.

2. Un frottis ou un échantillon de bactéries est prélevé sur cette culture.

3. Cet échantillon est fixé à la chaleur.

4. Substance n° 1 : un colorant, lecristal violet, est ajouté à l'échantillon.

5. Substance n°2 : de l'iode est ajouté à l'échantillon pour faire adhérer le cristal violet.

6. Substance n°3 : De l'éthanol (ou de l'acétone ou un autre alcool) est ajouté comme agent décolorant, c'est-à-dire pour éliminer les autres couleurs.

7. Substance n° 4 : Un nouveau colorant, la safranine, est ajouté. Cette étape est appelée contre-coloration.

Nous savons déjà que, dans l'ensemble, les bactéries gram-positives se colorent en violet au final, et que les bactéries gram-négatives se colorent en rose. Mais à quoi ressemblent-elles après chacune des étapes que nous avons décrites ci-dessus ? Sont-elles toujours les mêmes et à quel moment peut-on observer leur distinction de couleur ?

Comment fonctionne la coloration de Gram ?

La coloration de Gram répond à une logique scientifique : le cristal violet peut se lier aux peptidoglycanes présents dans la paroi cellulaire des bactéries. Selon l'épaisseur de cette paroi cellulaire, le colorant restera après l'ajout du décolorant ou non, conditionnant la couleur de la bactérie : violet s'il est resté (cristal violet), et rose s'il n'est pas resté, du fait que la cellule prend la couleur de la safranine.

Coloration de Gram positif

Les bactéries à Gram positif ont une paroi cellulaire épaisse (figure 3). Cette paroi cellulaire se trouve à l'extérieur de leur membrane cellulaire et est constituée d'un matériau appelé peptidoglycane (macromolécule formée de peptides et de sucres).

Après avoir ajouté du cristal violet et utilisé de l'iode comme mordant pour fixer le cristal violet sur la bactérie, l'épaisse paroi cellulaire de peptidoglycane se complexe solidement avec le duo cristal violet-iode. On ajoute ensuite l'éthanol, le décolorant. Cependant, comme la paroi de peptidoglycane est très épaisse, au lieu d'éliminer le complexe cristal violet-iode, l'éthanol provoque la fermeture des pores présents dans la paroi cellulaire, et la bactérie elle-même se déshydrate et rétrécit. Comme les pores sont fermés, le colorant cristal violet ne peut pas sortir de la paroi cellulaire et être éliminé par lavage. Ainsi, la coloration primaire violette demeure, même après l'ajout du décolorant. Ensuite, lorsque la safranine, le contre-teinture secondaire, est ajoutée, elle ne peut pas s'installer dans la paroi cellulaire bactérienne parce que le cristal violet s'y trouve déjà et n'a pas été éliminé par lavage.

Coloration à Gram négatif

Lesbactéries gram-négatives, en revanche, ont une paroi cellulaire très fine en peptidoglycane, et à l'extérieur de cette paroi cellulaire, elles ont une couche de membrane externe pleine de lipides et de lipoprotéines. Lorsque les bactéries gram-négatives rencontrent le colorant cristal violet, elles l'absorbent et deviennent violettes, et l'iode agit comme un mordant pour les aider à fixer cette couleur violette. Cependant, une fois le décolorant éthanol ajouté, l'alcool perturbe et dissout les lipides de la membrane externe. La membrane externe étant affaiblie et ne comportant plus qu'une fine couche de peptidoglycane, le cristal violet peut s'échapper de la cellule et la bactérie devient incolore à ce stade. Ensuite, la safranine, le contre-teinture, colore en rose la paroi cellulaire à Gram négatif, car le cristal violet a déjà été éliminé par lavage.

Bacillussubtilis coloration de Gram

Bacillus sub tilis est notre organisme d'exemple pour démontrer ce qui se passe lors de la coloration de Gram des organismes à Gram positif. Son genre : Bacillus, nous indique qu'il s'agit d'une bactérie en forme de bâtonnet. Mais de quelle couleur ces bâtonnets apparaîtraient-ils lors de la coloration de Gram (Fig. 1) ?

• Tout d'abord, bien sûr, nous prendrions une culture contenant du B. subtilis.

  • Lorsque l'on examine ces bactéries au microscope, elles sont naturellement incolores.

• Ensuite, nous fixons à la chaleur un frottis de B. subtilis.

  • Aucun changement de couleur n'est observé.

• Maintenant, nous ajoutons la première substance : le cristal violet.

  • Le cristal violet est un colorant qui donne aux bactéries de l'échantillon une couleur violette.

• Ensuite, nous ajoutons la deuxième substance : l'iode

  • L'iode a naturellement une couleur brun foncé ou bleu foncé. Ce n'est pas un colorant, donc les bactéries sont toujours violettes.

  • L'iode est considéré comme un mordant, ce qui signifie que c'est un agent fixateur. Il aide à fixer la couleur violette sur les bactéries.

• Maintenant, nous ajoutons la troisième substance : l'éthanol

  • L'éthanol, ou tout autre alcool utilisé dans cette étape, est un décolorant

  • Cependant, les bactéries gram-positives comme B. subtilis ne sont PAS décolorées par cette substance. Elles conservent leur couleur violette.

• Enfin, nous ajoutons la quatrième substance : la safranine

  • La safranine est le contre-colorant, et elle a une couleur rose

  • Cependant, la safranine ne peut affecter que les bactéries qui ont été correctement décolorées. Comme les bactéries Gram-positives ne sont PAS décolorées par l'éthanol, elles ne sont pas affectées par la safranine et terminent tout ce processus par une couleur violette.

Fig.1. Coloration de Gram de Bacillus subtilis. Tu peux voir que les bâtonnets sont violets, ce qui signifie qu'ils sont Gram-positifs.

Tu trouveras ci-dessous un tableau résumant les effets de chaque substance sur les insectes à Gram positif comme Bacillus subtilis (tableau 1).

Tableau 1 : étapes de la coloration de Gram pour les bactéries gram-positives.

Coloration de Gram d'E coli

Pour notre exemple étape par étape d'un organisme gram négatif, nous utiliserons une autre bactérie en forme de bâtonnet : Escherichia coli (Fig. 2). E. coli estgénéralement inoffensive, mais elle peut être à l'origine d'un grand nombre de maladies différentes, allant des infections urinaires à la diarrhée du voyageur en passant par la méningite chez les nouveau-nés. Les étapes de la coloration de Gram de l'E coliI sont les mêmes que pour n'importe quelle bactérie :

• Tout d'abord, nous prenons notre culture incolore d'E. coli et nous la fixons à la chaleur.

• Nous appliquons ensuite du cristal violet.

  • La bactérie apparaît alors en violet.

• Ensuite, nous appliquerons notre mordant, l'iode.

  • Aucun changement de couleur ne sera observé, l'E. coli sera toujours violet.

• Ensuite, nous utiliserions notre lavage à l'éthanol comme décolorant.

  • Les E. coli perdent leur couleur et deviennent incolores.

• Enfin, nous appliquons de la safranine, le contre-étain.

  • Les E. coli prennent la couleur du contre-teinture et deviennent roses.

Fig. 2. Coloration de Gram d'E. coli. Les bactéries à bâtonnets sont roses, ce qui signifie qu'elles sont à Gram négatif.

Tu trouveras ci-dessous un tableau résumant les effets de chaque substrat sur les bactéries à Gram négatif (tableau 2).

Tableau 2 : étapes de la coloration de Gram pour les bactéries gram-négatives

Coloration de Gram deStaphylococcus aureus

Comme autre exemple de bactérie à Gram positif, nous avons le staphylocoque doré qui, comme son nom l'indique, est une bactérie de type cocci. Dans ce cas, le processus de coloration est le même (cristal violet, puis iode, puis alcool et enfin safranine). Cependant, l'image finale au microscope montrera des sphères violettes et non des bâtonnets violets comme avec Bacillus subtilis.

Fig. 3. Coloration de Gram de Staphylococcus aureus. Tu peux voir que les cocci sont violets, ils sont donc Gram positifs.

Après cet article, nous espérons que tu comprends mieux la coloration de Gram : comment elle fonctionne, ce qu'elle indique et comment les couleurs sont un élément clé de la microscopie !