Réaction en chaîne par polymérase

Réaction en chaîne de la polymérase

Parmi les principales applications de la PCR, on peut citer l'amplification de l'ADN pour les tests médico-légaux. Par exemple, les tests Covid-19, la recherche, les tests de paternité, l'édition de gènes et bien d'autres encore.

Le processus de PCR nécessite des substrats et des conditions spécifiques :

• Le fragment d'ADN d'intérêt, qui servira d'ADN modèle.
• Taq ADN polymérase : cette enzyme réplique les fragments d'ADN. La Taq polymérase est obtenue à partir d'un type particulier de bactéries dans les sources chaudes. Par conséquent, la Taq polymérase tolère les températures élevées, contrairement à l'ADN polymérase humaine, qui se dénature à haute température.
• Nucléotides : Les nucléotides libres de l'ADN sont les éléments constitutifs de la synthèse de nouveaux brins d'ADN.
• Amorces : Les amorces sont des fragments composés de 18 à 30 nucléotides qui complètent les débuts de chacun des deux brins d'ADN à chaque extrémité. Leur présence est essentielle pour ce processus puisque l'ADN polymérase Taq ne peut se lier et répliquer qu'une région d'ADN à double brin. Les amorces se lient au début des deux brins d'ADN et permettent le recrutement de la Taq polymérase.
• Un thermocycleur (ou thermo-cycleur) : Un instrument qui augmente et abaisse automatiquement la température des échantillons dans un récipient fermé selon un programme.

Les fragments d'ADN, les amorces, les nucléotides et l'ADN polymérase Taq sont ajoutés dans un tube puis placés dans le thermocycleur.

Les étapes de la PCR

Le processus de PCR comprend trois étapes qui se répètent au cours de nombreux cycles. Ces étapes sont :

1. Dénaturation: Le thermocycleur augmente la température jusqu'à 95°C. À cette température, les liaisons hydrogène entre les paires de bases complètes, qui maintiennent les deux brins d'ADN ensemble, se rompent. Les deux brins des fragments d'ADN se séparent alors.
2. Recuit: Le thermocycleur refroidit la température du contenu à l'intérieur des récipients jusqu'à 55°C. Les amorces peuvent alors se lier à leur séquence de base complémentaire au début des brins d'ADN par le biais de liaisons hydrogène. Les amorces permettent le recrutement de l'ADN polymérase Taq sur les brins d'ADN et fournissent ainsi le site de départ pour la synthèse de l'ADN. Les amorces empêchent les deux brins de se recoller simplement en se liant aux brins du fragment d'ADN.
3. Extension: La température est augmentée à 72°C. C'est la température optimale pour l'ADN polymérase Taq, qui utilise les nucléotides d'ADN libres pour répliquer les brins. Elle ajoute des nucléotides d'ADN complémentaires à l'amorce et continue jusqu'à ce qu'elle atteigne l'extrémité du fragment.

Fig. 1 - Les trois étapes de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) : dénaturation, recuit et élongation.

À la fin de chaque cycle, le nombre de fragments d'ADN double. Par exemple, à la fin du premier cycle, il y aurait deux copies du fragment original, et à la fin du deuxième cycle, le nombre de copies serait de quatre.

Le processus est répété en de nombreux cycles pour amplifier le nombre de copies de fragments d'ADN jusqu'à la quantité souhaitée. Cette quantité peut dépendre du type d'application pour laquelle les fragments d'ADN seront utilisés.

Voici la formule utilisée pour calculer le nombre de molécules d'ADN après plusieurs cycles de PCR.

$NumberofDNAmolecules=2^n$

Avantages et inconvénients du clonage par PCR

L'utilisation de la méthode de clonage par PCR présente des avantages et des inconvénients.

Tableau 1. Avantages et inconvénients du clonage par PCR.

Avantages et risques du génie génétique, y compris la PCR

Le génie génétique a de nombreuses applications et de nombreux avantages. Il s'accompagne également de certains risques et implications éthiques, que nous devons prendre en compte. Voici quelques-uns des avantages et des risques de la technologie de l'ADN recombinant :

Tableau 2. Avantages et risques du génie génétique.