Définition de l'électrophorèse sur gel
L'électrophorèse sur gel existe depuis des décennies, en fait depuis les années 1960. C'estune méthode omniprésente utilisée pour quantifier et purifier les macromolécules (ADN, ARN, protéines).1 Elle est largement utilisée et très fiable. Elle constitue un élément fondamental de nombreuses autres techniques de laboratoire et biotechnologies importantes, comme la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), l'édition du génome et le séquençage des gènes.
L'électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire qui consiste à faire passer des macromolécules chargées à travers un gel sous l'effet d'un champ électrique afin de les séparer en fonction de leur taille .
Types d'électrophorèse sur gel
Il existe deux principaux types d'électrophorèse sur gel, les acides nucléiques et les protéines. L'électrophorèse sur gel des acides nucléiques est utilisée pour l'ADN et l'ARN. Le type d'électrophorèse sur gel et la longueur des fragments dans les échantillons utilisés influencent le gel utilisé. Le choix d'un gel approprié fait partie intégrante de l'électrophorèse sur gel, et il existe de multiples options. Les types de gel comprennent l'agarose, l'agar, le polyacrylamide et les composites agarose-acrylamide.
Les gels d'agarose et de polyacrylamide sont les plus couramment utilisés ; le gel d'agarose est le meilleur pour la majorité des acides nucléiques et des protéines de grande taille, tandis que le gel de polyacrylamide est le meilleur pour les acides nucléiques plus petits et la majorité des protéines.3 La densité de l'agarose dépend de la taille des fragments d'ADN ou d'ARN qui doivent être analysés.
Pour les fragments plus courts, une concentration plus élevée d'agarose est utilisée lors de la création du gel.
Étapes de l'électrophorèse sur gel
Le processus d'électrophorèse sur gel comporte de nombreuses étapes. L'électrophorèse sur gel implique l'utilisation d'un gel. Bien que les gels soient solides, ce sont des matrices poreuses qui permettent aux macromolécules de les traverser.2 Les gels peuvent être fabriqués en laboratoire ou achetés déjà préparés. Les gelsont des puits, ou indentations, à une extrémité où les échantillons sont placés.
Lorsque le gel est prêt à être utilisé, il est placé dans une cuve d'électrophorèse et recouvert d'un tampon liquide. C'est le tampon qui conduit le courant électrique. La taille des fragments de macromolécules à analyser détermine le type de tampon utilisé. Des électrodes positives et négatives sont placées aux extrémités opposées du
Les tampons. Tu te souviens peut-être d'avoir appris ce qu'étaient les tampons en cours de chimie et d'avoir laborieusement essayé d'équilibrer les équations des tampons. Un principe important que ton professeur a peut-être mentionné est le principe de Le Chat elier. Le principe de Le Chatelier stipule que les changements de concentration, de pression et de température déterminent la rapidité et l'efficacité d'une réaction chimique. Un tampon est une solution aqueuse composée d'un acide faible et de sa base conjuguée ou d'une base faible et de son acide conjugué. Les tampons permettent de maintenir un pH constant pendant les réactions chimiques et utilisent pour cela le principe de Le Chatelier.
Avant d'être chargés dans le gel, les échantillons de macromolécules, composés de plusieurs fragments de tailles et de concentrations différentes, sont teintés. La teinture permet une meilleure visualisation et rend les échantillons plus lourds, de sorte qu'ils ne flottent pas hors des puits après avoir été chargés. À l'aide d'une pipette, un marqueur de macromolécules ou une échelle et les échantillons de macromolécules sont chargés dans les puits du gel. Le marqueur/échelle de macromolécules est toujours placé dans le premier puits. Le marqueur/échelle est composé de fragments d'ADN, d'ARN ou de protéines de longueurs connues.
Le marqueur/chemin sert en quelque sorte de règle ; la position des échantillons est comparée à celle des fragments du marqueur pour déterminer la longueur des échantillons.
Lesmacromolécules migrent ou se déplacent à travers le gel, en se dirigeant vers la charge opposée. Par exemple, l'ADN et l'ARN sont chargés négativement en raison des molécules de phosphate chargées négativement dans les squelettes des acides nucléiques.1 Par conséquent, pour l'électrophorèse sur gel d'acide nucléique, l'électrode négative est placée à l'extrémité du gel avec les puits, et l'électrode positive est placée à l'autre extrémité afin que l'ADN et l'ARN migrent loin des puits vers l'extrémité positive.
Électrode : Un petit dispositif métallique qui transmet des signaux électriques à sa cible.
Le courant électrique est appliqué suffisamment longtemps pour permettre aux fragments de macromolécules de se séparer. Si un gel n'est pas run suffisamment long , la séparation des fragments de chaque échantillon sera faible ou inexistante. Si le gel est trop long, les fragments sortiront directement du gel et se perdront dans le tampon.
Une fois que le gel a fonctionné suffisamment longtemps pour permettre une séparation adéquate des fragments, il est retiré de la cuve d'électrophorèse et coloré avec un colorant fluorescent qui se lie aux macromolécules. Le gel est ensuite placé sous une lampe afin que les macromolécules colorées brillent. Les fragments de macromolécules de même taille apparaissent sous forme de bandes, et plus la bande est épaisse, plus la concentration de fragments est élevée.
Électrophorèse sur gel d'ADN
L'électrophorèse sur gel d'ADN est un type d'électrophorèse sur gel d'acide nucléique utilisé pour identifier, quantifier et purifier des fragments d'ADN. L'électrophorèse sur gel d'ADN peut également être utilisée dans d'autres contextes, comme la PCR, le clonage de l'ADN ou le séquençage de l'ADN. Jetons un coup d'œil à chacun de ces processus.
La PCR est l'abréviation de réaction en chaîne de la polymérase et est une technique de laboratoire utilisée pour faire des copies d'une séquence d'ADN spécifique à partir d'un échantillon qui contient très peu de cette séquence.
La PCR est le principal test utilisé pour détecter l'infection par COVID-19. Lorsqu'un échantillon est prélevé sur une personne atteinte de COVID-19, il est envoyé à un laboratoire pour être analysé par PCR. La quantité d' ADN viral est très faible par rapport à l'ADN de l'hôte.
L'électrophorèse sur gel est également utilisée pour le clonage et le séquençage de l'ADN. Ces techniques de laboratoire nous permettent de mieux comprendre legénomehumain ainsi que d'autres génomes animaux. Leséquençage de l'ADN consiste à déterminer la position exacte de chacune des quatre bases, ce qui nous permet de savoir quels codons sont présents dans quelsgènes . Cela nous permet de savoir quellesprotéines vont être exprimées, ce qui peut indiquer des mécanismes potentiels pour des maladies rares et incurables .
Schéma de l'électrophorèse sur gel
Pour résumer, pendant l'électrophorèse sur gel, des macromolécules chargées sont chargées dans un gel avec un champ électrique. Une extrémité du gel a une charge positive et l'autre une charge négative. Les macromolécules se déplacent des puits situés à une extrémité du gel vers l'extrémité opposée, celle dont la charge est opposée à celle des macromolécules. Les molécules plus petites se déplacent plus loin.
Les macromolécules et le gel sont colorés avec un colorant pour permettre la visualisation des fragments de macromolécules. Une échelle/un marqueur est toujours utilisé(e) car il sert de règle pour mesurer la longueur des fragments. La taille des fragments est estimée en fonction de leur emplacement par rapport aux fragments du marqueur, dont les longueurs sont connues.
Électrophorèse sur gel - Principaux enseignements
- L'électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire courante utilisée pour quantifier et purifier les macromolécules (ADN, ARN, protéines).
- L'électrophorèse sur gel consiste à faire passer des macromolécules chargées à travers un gel soumis à un champ électrique afin de les séparer en fonction de leur taille.
- Il existe deux principaux types d'électrophorèse sur gel : les acides nucléiques et les protéines. L'électrophorèse sur gel des acides nucléiques est utilisée pour l'ADN et l'ARN.
- Le
type de gel utilisé est à analyser.déterminé par le type de macromolécule et la taille des échantillons de macromolécules
Références :
Nucleic Acid Gel Electrophoresis-A Brief Overview and History, s.d. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/na-electrophoresis-education/na-separation-overview.html
Qu'est-ce que l'électrophorèse sur gel ?, 21 juillet 2021. https://www.yourgenome.org/facts/what-is-gel-electrophoresis
Aperçu de l'électrophorèse des protéines, s.d. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresis.html
Réaction en chaîne de la polymérase (PCR), 26 août 2022 https://www.genome.gov/genetics-glossary/Polymerase-Chain-Reaction
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